編集者注: なんともエキサイティングですね! 最近、癌の原因として寄生虫を挙げたニュースが流れました。この声明は、イベルメクチンには抗寄生虫作用があるため、癌の治療法としてイベルメクチンが使用されることを証明しています。
以下の専門用語をさらに読んで、医師にイベルメクチンを 1 ～ 2 回投与してもらい、健康的な生活を送ってください。
クォンタムジョイ！
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m J 癌研究所。 2022年; 12(10): 4502–4519。
2022 10 15にオンラインで公開されました。
腫瘍の転移はがんによる死亡の主な原因です。したがって、抗転移療法に効果的な治療薬を発見することが不可欠です。今回の研究では、FDA 承認の抗寄生虫薬であるイベルメクチン (IVM) ががん転移を予防できるかどうかを調査しました。結腸直腸癌および乳癌の細胞株と癌細胞由来の異種移植片腫瘍転移モデルを使用して、IVM の抗転移効果を調査しました。我々の結果は、IVMがin vitroでの癌細胞の運動性 とin vivoでの 腫瘍転移を 有意に阻害することを示した。機構的には、IVMは、Wnt/β-カテニン/インテグリンβ1/FAKおよび下流のシグナル伝達カスケードの活性化を阻害することにより、遊走関連タンパク質の発現を抑制した。私たちの調査結果は、IVMが腫瘍転移を抑制できることを示しており、これはがん転移の予防と治療におけるIVMの臨床応用の可能性を探る根拠を提供しました。
キーワード: がん転移、Wnt/β-カテニン/インテグリンβ1/FAK、異種移植モデル、アベルメクチン、結腸直腸がん、乳がん、HCT-8、抗転移
がん細胞は、腫瘍の形成と進行の過程で転移しやすい傾向があります。それらは原発部位から離脱し、体の他の部分に定着して増殖し、重要な器官や身体システムの機能障害を引き起こす可能性があります [ 1 – 3 ]。腫瘍転移のプロセスは複雑であり、上皮細胞が高い遊走能力と浸潤能力を持つ間葉系細胞に変化するプロセスである上皮間葉転換（EMT） [ 4、5 ]、腫瘍微小環境 [ 6 ]、細胞間コミュニケーション [ 7 ]、細胞と細胞外マトリックスの相互作用 [ 8 – 11]、細胞極性、細胞骨格の可塑性 [ 12、13 ]、標的組織における癌細胞の定着 [ 14 ]。しかし、腫瘍転移を制御する効果的な臨床戦略はまだ限られています。
いくつかのシグナル伝達経路が、プロセスの 1 つまたは複数のステップを制御することによって腫瘍転移に関与しています [ 15 – 18 ]。例えば、Wnt/β-カテニンおよびインテグリンβ1/FAKシグナル伝達経路は、EMTの制御[21]、パキシリンの活性化、およびRho GTPaseファミリータンパク質の発現の増強により、腫瘍転移において重要な役割を果たしている[ 19、20 ] 。したがって、一部の薬物または植物抽出物は、その活性を調節することによって転移を調節することが報告されている[ 23 – 27 ]。
アベルメクチン B1 の誘導体であるイベルメクチン (IVM) は、16 員マクロライド化合物のクラスに属し、寄生虫、害虫、病気を媒介する昆虫の治療に広く使用されています [ 28 – 31 ]。重要なことに、2 つのマクロライド化合物、アバメクチンとドラメクチンは、マウス神経芽腫 N2a 細胞における細胞骨格タンパク質の発現を阻害することが報告されています [ 32 ]。さらに、研究では、IVMとアベルメクチン単糖類似体であるセラメクチンの両方が、 in vitroで乳がんMDA-MB-231細胞の遊走を阻害し、セラメクチンがin vivoでマウス4T1乳がん細胞の肺転移を阻害することが 示されている [ 33 ]。これらの発見に基づいて、我々はIVMががん細胞の運動性を阻害する効果があるのではないかと推測しました。
この研究では、細胞遊走と腫瘍転移に対するIVMの影響を調査しました。複数の腫瘍細胞株と異種移植腫瘍モデル[ 34、35 ]を使用することにより、我々は腫瘍転移に対するIVMの阻害を明らかにしただけでなく、癌細胞の運動性に対するIVMの阻害効果を媒介する新規な分子機構も同定した。
材料と方法
細胞培養
ヒト結腸直腸癌 HCT-8 細胞株および乳癌 MCF-7 細胞株は、Shanghai Huiying Biological Technology Co. Ltd (上海、中国) から入手しました。ヒト結腸直腸癌 HCT-116 細胞株および乳癌 MDA-MB-231 細胞株は Nanjing KeyGen Biotech Inc. (江蘇省、中国) から入手しました。EGFR ノックアウト HCT-116 細胞株 [ 36 ] は、中国医学科学院 (中国、北京) の Ningzhi Xu 博士のご厚意により提供されました。全ての細胞を、10% FBSを補充したRPMI-1640培地(Sigma-Aldrich)中で37℃、5% CO 2の加湿雰囲気下で培養した。
化学薬品および試薬
イベルメクチン (純度 > 95%) は、Dalian Meilun Biological Technology Co. Ltd (遼林、中国) から購入しました。硫酸ビンクリスチン (純度 ≥ 96.7%) は、Wuhan Yuancheng Gongchuang Technology Co. Ltd (湖北省、中国) から購入しました。アドリアマイシンは、KeyGen Biotech (江蘇省、中国) から購入しました。CK1 活性化剤 パモ酸ピルビニウム [6-(ジメチルアミノ)-2-[2-(2,5-ジメチル-1-フェニルピロール-3-イル)エテニル]-1-メチル-キノリニウム; PP]は、Sigma-Aldrich (セントルイス、ミズーリ州、米国) から購入しました。Millicell 吊り下げ細胞培養インサートは、EMD Millipore Corporation (米国マサチューセッツ州ビレリカ) から購入しました。マトリゲルは、Corning Incorporated (米国マサチューセッツ州ベッドフォード) から購入しました。組換えヒト Wnt3a タンパク質は、R&D Systems (米国ミネソタ州ミネアポリス) から購入しました。GSK3β (#9832)、p-GSK3β ser9 (#5558)、β-カテニン (#8480)、p-β-カテニン (#9561)、LRP6 (#2560)、p-LRP6 (#2568)、frizzled5に対する抗体(#5266)、ヒストン H3 (#4499)、E-カドヘリン (#5296)、Rac1/Cdc42 (#4651)、ビメンチン (#3932)、FAK (#3285)、p-FAK (#3283)、パキシリン ( #2542)、p-パキシリン (#2541)、およびカタツムリ (#3879) は Cell Signaling Technology (米国マサチューセッツ州ボストン) から購入しました。TCF4 (ab217668)、インテグリンβ1 (ab52971)、および MMP9 (ab38898) に対する抗体は、Abcam (Cambridge, UK) から入手しました。RhoA、Rac1、および Cdc42 に対する抗体は Cytoskeleton (米国コロラド州デンバー) から購入しました。Life Technologies Corporation (米国カリフォルニア州カールズバッド) の ZO-1 (339100) およびオクルディン (331500) を検出する抗体。チューブリン（sc20852）およびGAPDH（CW0100）に対する抗体は、それぞれSanta Cruz Biotechnology（米国カリフォルニア州サンタクルーズ）およびCoWin Biotechnology（北京、中国）から購入しました。
異種移植腫瘍モデルとIVM治療
生後 4 週間の雄の非肥満糖尿病/重度複合免疫不全 (NOD/SCID) マウス (Vital River) を in vivo アッセイで使用し、腫瘍の進行と転移に対する IVM の効果をテストしました。マウスには標準的なげっ歯類の餌と水を自由に与え、個別に換気されたケージラック上でケージ当たり５匹のマウスを飼育した。
異種移植結腸直腸癌モデルを確立するために、1×10 7個のHCT-8細胞100μl をマウスの脇腹領域に皮下接種した。腫瘍の増殖をモニタリングし、腫瘍サイズが約 100 mm 3に達したとき、マウスを無作為に 3 つのグループに分けました (n = 3/グループ)。IVM溶液(0.9% NaCl中)を、それぞれ0、2、および3 mg/kg/日の用量で18日間毎日腹腔内注射した。０．９％ＮａＣｌ溶液の注射をビヒクル対照として使用した。腫瘍サイズはキャリパーを使用して 3 日ごとに測定し、腫瘍体積は V = 長さ × 幅2 /2 として計算されました。治療の最後に、腫瘍を解剖し、重量を測定した。
結腸直腸癌転移モデルを確立するために、2×10 6 HCT-8細胞100μlの尾静脈静脈内注射を 実施し、マウスを4つのグループに無作為に分けた(n = 6/グループ)。IVM治療群の場合、IVM溶液を、それぞれ0、1、2、および3 mg/kg/日の用量で37日間毎日腹腔内注射した。０．９％ＮａＣｌ溶液の注射をビヒクル対照として用いた。治療の最後に、組織学的検査のために腫瘍結節を解剖し、4% パラホルムアルデヒドで固定しました。
すべての動物実験は中国の法律のガイダンスに従って実施され、動物プロトコルは中国科学院動物研究所の動物および医療倫理委員会によって審査および承認されました。
RhoA/Rac1/Cdc42 活性化アッセイ
約３０％コンフルエンスにある細胞をＩＶＭおよび／またはＶＣＲで２０分間処理し、溶解して遠心分離によって上清を収集した。次に、上清を、Combo RhoA/Rac1/Cdc42 活性化アッセイ Biochem Kit (Cytoskeleton、デンバー、 CO、米国) 4°C で 1 時間回転させます。結合複合体を遠心分離によって回収し、1回洗浄し、沈殿したビーズをウェスタンブロッティング分析のために40μlの2×ローディングバッファーに再懸濁した。
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
TCF4 結合部位とインテグリン β1 遺伝子の注釈付き転写開始部位を含む 2,200 bp のプロモーター フラグメント [-2000 ～ +200 bp、chr10: 32958145-32960365 (hg38)] を、ガウシアルシフェラーゼ (GLuc) レポーター ベクター (pEZX) にクローニングしました。 -PG04、GeneCopoeia)、トランスフェクション正規化のための分泌型胎児性アルカリホスファターゼ (SeAP) が含まれています。
トランスフェクション試薬VigoFectを使用して、24ウェルプレート内の細胞を上記のレポーターベクターおよびpcDNA3.1(+)-TCF4またはpcDNA3.1(+)-β-カテニン発現ベクターで同時トランスフェクトした。トランスフェクションの 12 時間後、細胞を示されているように 48 時間処理しました。GLuc および SeAP の活性は、Secrete-Pair TM デュアル発光アッセイ キット (GeneCopoeia) を使用して定量されました。
免疫蛍光分析
細胞を4%パラホルムアルデヒドで室温(RT)で15分間固定し、0.5% Triton X-100で室温で10分間透過処理し、抗体とインキュベートする前に3% BSAを含むTBSTで37℃で1時間ブロックしました。 β-カテニン、E-カドヘリン、ZO-1、オクルディンに対して37℃、1.5時間。染色シグナルは、FITC 標識二次抗体を使用して 37°C で 1 時間視覚化し、蛍光顕微鏡で検査しました。すべての画像は、Carl Zeiss LSM710 レーザー走査型共焦点顕微鏡 (Oberkochen、ドイツ) を使用して取得されました。
組織化学染色
ヘマトキシリンおよびエオシン染色は、標準プロトコールに従って実行されました。簡単に説明すると、組織切片を脱パラフィンし、アルコール濃度を下げて再水和し、ヘマトキシリンで 15 分間染色し、分化した後、エオシンで 3 分間染色し、その後アルコールとキシレンで脱水しました。切片をマウントし、オリンパス IX71 倒立顕微鏡 (東京、日本) で検査しました。
プラスミド構築と細胞トランスフェクション
ヒト完全長 β-カテニン ( X87838.1 )、TCF4 ( NM_001083962.1 )、インテグリン β1 (ITGB1 A) ( NM_002211.3 )、および FAK ( L13616.1 ) をコードする DNA 配列を哺乳類発現ベクター pcDNA3.1 にクローニングしました。 (+) ベクトル (GENEWIZ)。HCT-8 細胞は、トランスフェクション試薬 VigoFect (Vigorous Biotech、北京、中国) を使用してトランスフェクトされました。
創傷治癒アッセイ
HCT-8 細胞と MCF-7 細胞を 24 ウェル プレートで 90% コンフルエンスまで増殖させました。20μlの滅菌チップを傷の引っ掻きに使用した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いでＲＰＭＩ－１６４０培地（１％ＦＢＳを含む）中で示されたように処理した。24 時間後の創傷面積の減少を倒立顕微鏡で視覚化し、CellSens 標準ソフトウェアで定量化し、時間 0 の同じ面積と比較しました。創傷閉鎖のパーセントは、24 時間の創傷面積と時間 0 の創傷面積の比でした。
トランズウェルアッセイ
トランスウェル遊走アッセイは、8.0 μm 孔のポリカーボネート膜インサートを備えた 24 ウェル チャンバー内で実施されました。簡単に説明すると、24時間飢餓状態にした細胞を、薬物処理ありまたはなしで上部チャンバーの200μl無血清培地に播種し、下部チャンバーを20% FBS完全培地で満たした。48 時間インキュベートした後、上部チャンバーの上面を綿棒で優しく拭き取り、下面を固定して 0.1% クリスタル バイオレットで染色しました。侵入細胞の数を倒立顕微鏡下で測定し、ImageJ ソフトウェアを使用して定量しました。
ウェスタンブロッティング分析
簡単に説明すると、細胞を RIPA バッファー (50 mM Tris、pH 7.5、150 mM NaCl、1% Triton X-100、1 mM EDTA、1% デオキシコール酸ナトリウム、1 mM PMSF および 1% プロテアーゼ阻害剤を含む) で溶解し、溶解物を、4℃、5,000 gで15分間の遠心分離によって清澄化した。上清を収集して定量し、タンパク質溶解物を SDS-PAGE で分離しました。タンパク質をミリポア PVDF 膜 (ダルムシュタット、ドイツ) に転写しました。膜を、TBST緩衝液中の5%無脂肪乳またはBSAを用いて室温で2時間ブロックし、その後、一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートした。TBSTで十分に洗浄した後、膜を適切な二次抗体とともにRTで3時間インキュベートしました。シグナルは、ECL 試薬 (Beyotime Biotechnology、中国、上海) によって生成され、DNR MicroChemi4.2 システム (Bio-Imaging Systems Ltd、イスラエル) によって検出されました。ウエスタンブロッティング画像は、Quantity One ソフトウェアによって分析されました。
細胞質および核タンパク質抽出物
細胞を細胞質抽出緩衝液（20 mM HEPES、pH 7.2、210 mM スクロース、70 mM マンニトール、10 mM KCl、1 mM DTT、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1 mM PMSF、および 1% プロテアーゼ阻害剤）を用いてホモジナイズしました。氷上でガラスホモジナイザーに置き、その後 30 分間インキュベートしました。細胞ホモジネートを溶解し、４℃、６００ｇで１５分間遠心分離することにより上清を細胞質抽出物として収集した。細胞ペレットを核抽出バッファー (50 mM Tris、pH 7.5、150 mM NaCl、1% Triton X-100、1 mM EDTA、1% デオキシコール酸ナトリウム、1 mM PMSF および 1% プロテアーゼ阻害剤) に再懸濁し、30 分間超音波処理しました。氷上で 30 分間インキュベートし、その後 4℃、12,000 g で 15 分間遠心分離しました。上清を核抽出物として回収した。
クロマチン免疫沈降アッセイ
クロマチン免疫沈降（ChIP）は、EZ ChIPキット（EMD Millipore）を使用して実施しました。簡単に説明すると、IVM で 48 時間処理した HCT-8 細胞を収集し、ホルムアルデヒドで架橋しました。クロマチンを超音波処理した後、TCF4、抗 RNA ポリメラーゼ II (陽性対照)、または正常ウサギ IgG (陰性対照) をそれぞれ使用して免疫沈降しました。免疫沈降した DNA 断片は、TaKaRa SYBR Premix Ex Taq TM (Tli RNaseH Plus) PCR キット (大連、中国) を使用した qPCR 分析によって検出されました。インテグリン β1 プロモーター (-317 ～ -661 bp) のプライマーは、5'-TGTTCCCCATAAAGGTACCTC-3' (センス) および 5'-TTCGACCCTCGCTCCCGTTTG-3' (アンチセンス) でした。定量的 PCR アッセイは、Axygen MX3000P リアルタイム サーモサイクラー (カリフォルニア州、米国) を使用して実行されました。
統計分析
一部の WB 実験を 2 回繰り返した場合を除き、すべての実験を少なくとも 3 回繰り返しました。統計分析では、一元配置分散分析 (ANOVA) とそれに続くダネット検定を多重比較に使用しました。P < 0.05の値は 統計的に有意であるとみなされ、 P < 0.01 の値は非常に有意であると考えられます。すべてのデータは、特に示されない限り、平均値±SDとして表されました。
結果
IVMはin vitroで複数のがん細胞の運動性を阻害した
我々は最初に、創傷治癒アッセイによってMCF-7細胞およびMDA-MB-231細胞の遊走に対するIVMの効果を評価した。我々は、1.5～8.0μMの濃度のIVMが用量依存的に細胞遊走を顕著に阻害することを発見した(図1A、 1B)1B )。さらに、細胞遊走は、一般的に使用される抗がん剤であるアドリアマイシン（ADR）と組み合わせたIVMによっても阻害されましたが、ADR単独では細胞遊走に対する影響は最小限でした（図2A、 2B2B）。
IVM はin vitro で癌細胞の移動を阻害しました 。乳がん MCF-7 細胞 (A) および MDA-MB-231 細胞 (B)、結腸直腸がん HCT-8 細胞 (C) および HCT-116 細胞 (D) の創傷治癒アッセイおよびトランスウェル遊走アッセイ。測定: IVM 治療のそれぞれ 0、24、および 48 時間後。IVMの濃度は示されたとおりであった。上のパネル: 創傷閉鎖の定量: ([0 時間での創傷の距離 – 24 時間での創傷の距離]/0 時間での創傷の距離 × 100%)。左下のパネル: トランスウェル遊走アッセイの定量。スケールバー = 250 μm。ビヒクルで処理した細胞を対照として使用した。ヒストグラムのデータは平均値 ± SD (n = 3) として表されました。*P < 0.05、**P < 0.01、それぞれの対照と比較。
IVM 単独または抗がん剤との併用は、 in vitroでがん細胞の移動を阻害しました 。乳がんの MCF-7 細胞 (A) と MDA-MB-231 細胞 (B)、および結腸直腸がんの HCT-8 細胞 (C) と HCT-116 細胞 (D) を、抗がん剤の存在下または非存在下で IVM で処理しました。薬物アドリアマイシン (ADR) (A および B) またはビンクリスチン (VCR) (C および D)。創傷治癒アッセイは、IVM 単独または ADR または VCR と組み合わせた治療後、それぞれ 0 時間および 24 時間で実施されました。創傷閉鎖の定量化は、 図 1に記載されているように実行されました。スケールバー = 250 μm。ビヒクルで処理した細胞を対照として使用した。ヒストグラムのデータは平均値 ± SD (n = 3) として表されました。**P < 0.01、それぞれの対照と比較。
一貫して、IVM はヒト結腸直腸癌細胞 HCT-8 および HCT-116 細胞の遊走を阻害しました。IVMは、単独または一般的に使用される抗がん剤であるビンクリスチン(VCR)と組み合わせてHCT-8細胞の遊走を阻害しましたが、VCR単独では有意な効果はありませんでした(図1C および 2C)。2C )。同様に、IVMは、1.25～5.00μMの濃度で用量依存的にHCT-116細胞の遊走を阻害した(図1D )。しかし、HCT-8細胞とは異なり、VCR単独でもHCT-116細胞の遊走を阻害でき、VCRとIVMの組み合わせはHCT-116細胞の遊走をさらに阻害した(図2D )。
これらの細胞株ベースの研究を総合すると、IVM は抗がん剤と併用した場合でも複数の種類のがん細胞の移動を阻害できることが示されました。
